Тест-система для фенотипического определения лекарственной чувствительности клинических изолятов микобактерий туберкулеза на основе применения микобактериофагов

Проблема ускоренного фенотипического исследования лекарственной чувствительности клинических изолятов микобактерий туберкулеза (МБТ) остается актуальной.

Цель исследования: разработка новой тест-системы для ускоренного фенотипического определения лекарственной чувствительности клинических изолятов МБТ к противотуберкулезным препаратам (ПТП) первого и второго рядов на основе применения литических микобактериофагов.

Материалы и методы. Культуры МБТ (108 клинических изолятов после первичного культивирования в системе Bactec MGIT) инкубировали 48 ч в присутствии ПТП, затем 48 ч после добавления литического микобактериофага D29. Последующая мультиплексная реакция полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяла провести количественный анализ ДНК МБТ и ДНК микобактериофага. Лекарственная чувствительность исследуемого образца оценивалась по величине различий пороговых уровней флюоресценции, соответствующих количеству микобактериофага, между контрольной и опытной пробой. Одновременно лекарственная чувствительность/устойчивость всех клинических изолятов МБТ после рекультивирования анализировалась в системе Bactec MGIT, который был принят в качестве эталонного метода.

Результаты исследования. Определение на основе применения литического микобактериофага лекарственной чувствительности/устойчивости 108 изолятов МБТ к четырем препаратам первого ряда и 90 изолятов к шести препаратам второго ряда ПТП продемонстрировало высокий уровень совпадения с результатами в системе Bactec MGIT. Это позволило определить 99,5%-ную чувствительность и 100%-ную специфичность метода для 3 препаратов первого ряда в целом; несколько ниже для этамбутола (86 и 96,9% соответственно), а также чувствительность 94,83% при специфичности 98,85% – для препаратов второго ряда.

1. Аляпкина Ю. С., Алексеев Я. И., Варламов Д. А., Домотенко Л. В., Шипи- на Л. К., Владимирский М. А. Разработка технологии ПЦР в реальном времени для экспресс-определения лекарственной устойчивости микобактерий туберкулеза к противотуберкулезным препаратам резервного ряда: фторхинолонам, амикацину и капреомицину // Туб. и болезни легких. – 2014. – № 12. – С. 69-75.

2. Аляпкина Ю. С., Ларионова Е. Е., Смирнова Т. Г., Алексеев Я. И., Черноусова Л. Н., Владимирский М. А. Изучение спектра и частоты встречаемости мутаций гена embB микобактерий туберкулезного комплекса, ассоциируемых с устойчивостью к этамбутолу, методом полимеразной цепной реакции в реальном времени // Туб. и болезни легких – 2017. – Т. 95, № 11. – С. 27-35. DOI: 10.21292/2075-1230-2017-95-11-27-35.

3. Владимирский М. А., Аляпкина Ю. С., Варламов Д. А. и др. Применение метода ПЦР в реальном времени для определения и контроля за распространением лекарственно-устойчивых штаммов микобактерий туберкулеза // Пробл. туберкулеза и болезней легких. – 2008. – № 4. – С. 38-44.

4. Домотенко Л. В., Морозова Т. П., Шемякин И. Г., Шелепин А. П. Опыт использования ТБ тест набора для ускоренного определения лекарственной чувствительности M. tuberculosis // Клиническая лабораторная диагностика. – 2020. – Т. 65, № 2. – С. 122-130.

5. Михайлович В. М., Лапа С. А., Грядунов Д. А., Владимирский М. А., Шипи- на Л. К. и др. Использование методов гибридизации и ПЦР на специализированном ТБ-микробиочипе для обнаружения рифампицин-резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины – 2001. – Т. 131, № 1. – С. 112-117.

6. Смирнова Н. С., Шипина Л. К., Лапенкова М. Б., Владимирский М. А. Применение литического микобактериофага D29 для разработки ускоренного фенотипического метода определения чувствительности микобактерий туберкулеза к широкому спектру противотуберкулезных препаратов // Клиническая лабораторная диагностика. – 2017. – Т. 62, № 12 – С. 757-763.

7. Clopper-Pearson Confidience Interval; Clopper C., Pearson E. (1934). The use of confidence or fiducial limits illustrated in the case of the binomial // Biometrika. ‒ Vol. 26, № 4. ‒ Р. 404-413. doi:10.2307/2331986.

8. Denkinger C. M., Schumacher S. G., Boehme C. C. et al. Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis: a systematic review and meta-analysis // Eur. Respir. J. – 2014. ‒ Vol. 44. – P. 435-446.

9. Dicks Kr., Stout J. Molecular diagnostics for Mycobacterium tuberculosis infection // Ann. Rev. Med. – 2019. – Vol. 70. – P. 77-90.

10. Foonglada S., Klayut W., Chinli R., Pholwat S. et al. Use of mycobacteriophage quantitative PCR on MGIT broths for a rapid tuberculosis antibiogram // J. Clin. Microbiol. – 2014. – Vol. 52, № 5. – P. 1523-1528.

11. Genestet C., Hodille E., Berland J. L. et al. Whole-genome sequencing in drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis in routine practice in Lyon, France // Int. J. Antimicrob. Agents. – 2020. – doi: 10.1016/j.ijantimicag.2020.105912.

12. Global tuberculosis report 2019. World Health Organisation – 2019.

13. Grace Lin S., Desmond E., Bonato D., Gross W., Siddiqi S. Multicenter Evaluation of BACTEC MGIT 960 System for Second Line Drug Susceptibility Testing of Mycobacterium tuberculosis Complex // J. Clin. Microbiol. – 2009. – Vol. 47, № 11. – P. 3630-3634.

14. Heyckendorf J., Andres S., Koser Cl. et al. What is a resistance. Impact of phenotypic versus Molecular drug resistance testing on therapy for multi and extensively drug resistant tuberculosis // Antimicrob. Agents Chemother. – 2018. – Vol. 62. – P. 1-12.

15. Horne D. J., Pinto L. M., Arentz M., Lin S.-Y. G., Desmond E., Flores L. L. et al. Diagnostic accuracy and reproducibility of WHO-endorsed phenotypic drug susceptibility testing methods for first-line and second-line antituberculosis drugs // J. Clin. Microbiol – 2013. – Vol. 51. – P. 393-401.

16. Hunt M., Bradley Ph., Lapierre S. et al. Antibiotic resistance prediction for Mycobacterium tuberculosis from genome sequence data with Mykrobe // Wellcome Open Research. – 2019. – Vol. 4. – P. 1-32.

17. Nathavitharama R., Cudahy P., Shumacher S et al. Accuracy of line probe assays for the diagnosis of pulmonary and multidrug-resistant tuberculosis: a systematic review and meta-analysis // Eur. Respir. J. – 2017. – Vol. 49. doi: 10.1183/13993003.01075-2016.

18. Nosova E., Zimenkov D., Khakhalina A. A сomparison of the Sensititre MycoTB Plate, Bactec MGIT 960, and a microarray-based molecular assay for the detection of drug resistance in clinical Mycobacterium tuberculosis isolates in Moscow, Russia // PLOS One – 2016. doi: 10.1371/journal.pone.0167093.

19. Pholwat S., Ehdaie B., Foongladda S., Kelly K., Houpt E. Real-time PCR using mycobacteriophage DNA for rapid phenotypic drug susceptibility results for Mycobacterium tuberculosis // J. Clin. Microbiology – 2012. – Vol. 50, № 3. – P. 754-761.

20. Rice J. P., Seifert M., Moser K. S., Rodwell T. C. Performance of the Xpert MTB/RIF assay for the diagnosis of pulmonary tuberculosis and rifampin resistance in a low-incidence, high-resource setting // PLOS One. – 2017. – Vol. 12. doi: 10.1371/journal.pone.0186139.

21. Schön T., Miotto P., Köser C. U., Viveiros M., Böttger E., Cambau E. Mycobacterium tuberculosis drug-resistance testing: challenges, recent developments and perspectives. // Clin. Microbiol. Infect – 2017. – Vol. 23. – P. 154-160.

22. van Beek J., Haanpera M., Smit P. et al. Evaluation of whole genome sequencing and software tools for drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis // Clin. Microbiol. Infection. – 2019. – Vol. 25. – P. 82-86.

23. Walker T. M., Kohl T. A., Omar S. V. et al. Whole-genome sequencing for prediction of Mycobacterium tuberculosis drug susceptibility and resistance: a retrospective cohort study // Lancet Infect. Dis. – 2015. – Vol. 15. – P. 1193-1202.